Lista przedmiotów z materiałami udostępnionymi dla studentów

Dla_studentów
  • Increase font size
  • Default font size
  • Decrease font size

Agata Staszelis

Immunohistochemiczna klasyfikacja neuronów 5 warstwy MEC - przyśrodkowej kory śródwęchowej mózgu myszy przy użyciu mikroskopu konfokalnego


Immunochemical classification of neurons in layer 5 of mouse brain medial entorhinal cortex using confocal laser scanning microscopy


Opiekun pracy dyplomowej: prof. dr hab. inż. Andrzej Materka
Dodatkowy opiekun pracy dyplomowej: prof. Menno Witter

Praca dyplomowa magisterska obroniona 2017-07-05
Streszczenie pracy dyplomowej:
Połączenia wewnątrz mózgu są aktualnym i intrygującym tematem badań neurobiologicznych. Przekazywanie informacji między obszarami mózgu jest bardzo złożone i wymaga jeszcze wielu studiów, makro- i mikroskopowych. Niniejsza praca przyczynia się do pogłębienia wiedzy na ten temat, poprzez analizę cech i zróżnicowania specyficznej populacji neuronów w mózgu myszy. Badane neurony obecne są w warstwie V przyśrodkowej kory śródwęchowej, skąd procesy pamięciowe mogą być przekazane z hipokampa do dalszej kory mózgowej - i, co istotne, otrzymują jednocześnie dwa sygnały z dwóch regionów mózgowych odpowiedzialnych za procesy pamięciowe (z podpory oraz obszaru kory pomiędzy formacją hipokampa i płatem ciemieniowym, za tylną częścią ciała modzelowatego). Obecność podwójnych sygnałów udowodniono w poprzednich badaniach i w każdym z 400 μm, horyzontalnych skrawków wypełniono aż do czterech takich neuronów. Była potrzeba klasyfikacji tych komórek pod kątem: morfologii oraz ekspresji czynników transkrypcyjnych; był to problem, którego rozwiązaniem zajęto się podczas tego projektu badawczego. Pierwsza z zastosowanych metod to klasyfikacja morfologiczna, która jest sposobem charakteryzacji kształtu pojedynczych neuronów. Druga, niedawno opracowana metoda pozwala podzielić neurony na dwie, niepokrywające się podkategorie, występujące w powierzchniowej warstwie V (LVa) oraz głębokiej warstwie V (LVb), za pomocą immunohistochemicznego barwienia przeciw odpowiednio Etv1 oraz Ctip2. Podział ten zostaje uwidoczniony, dzięki fluorescencyjnemu oznaczeniu neuronów. Taka charakteryzacja, która jest celem tej pracy, nigdy wcześniej nie została wykonana na neuronach otrzymujący podwójne wejście. W tym projekcie immunobarwienie użyto do zaznaczenia konkretnych neuronów, obrazowanie konfokalne do zobrazowania zaznaczonych komórek, analizę morfologii do zbadania typu i kształtu neuronów, co zakończono subiektywną wzrokową analizą zabarwionych próbek. Protokół został pomyślnie ustanowiony dla barwienia przeciw Ctip2, a dane z tego wynikające pokazały, że większość neuronów piramidalnych była zabarwiona, podczas gdy większość neuronów horyzontalnych oznaczona nie była. To może wskazywać na to, że wśród badanych neuronów otrzymujących, większość komórek piramidalnych leży w LVb, a większa część neuronów horyzontalnych w LVa. Te wyniki mogą wskazywać na to, iż badane neurony mogą być połączone z innymi lokalnie (horyzontalne) oraz do dalszych obszarów mózgu (piramidalne), co może mieć wpływ na szersze zrozumienie połączeń wewnątrz mózgu oraz tego, jak mózg pracuje całościowo.
Abstract:
Internal brain connections are a hot topic in the field of neuroscientific research. The answer to how information is sent from one brain area to another seems to be a highly complex problem and requires many detailed studies both on a macro and microscopic levels. This project contributes to the latter research and investigates the features and diversity of a specific population of neurons in mouse brain. The examined neurons are found in layer V of medial entorhinal cortex (MEC) - the brain area, thanks to which memory processes can be transferred from hippocampus to the rest of the cortex, and, importantly, they have dual input from subiculum and retrosplenial cortex (RSC). Those two areas in the brain are also connected to memory processing. The existence of this input was proven in previous studies and up to four such neurons were filled with a molecular marker in each horizontal 400 μm slice. There was a need to classify those neurons in terms of morphology and transcription factor expression; this was the issue tackled by this research project. The first of the applied methods is the morphological classification, which is a popular way of characterizing single neurons in terms of their shape. The second method is very recent and divides LV neurons into two, non-overlapping subpopulations - LVa and LVb - by immunohistochemical staining for Etv1 and Ctip2 respectively. It allows to visualize this division, thanks to neuronal fluorescence labeling. This characterization, which was the aim of this project, has never been carried out on neurons that would receive the dual input from both subiculum and retrosplenial cortex. In this project, immunohistochemical staining was used to mark the needed neurons, confocal imaging to picture the marked cells, morphological analysis to inspect the shape and type of those neurons, followed by subjective, visual analysis of the stained samples. The protocol was successfully established for Ctip2 staining, and the data resulting from the staining showed that the vast majority of pyramidal neurons were labeled by Ctip2, while most of horizontal neurons were not. This may indicate that among the neurons receiving the convergent input from subiculum and RSC, most of the pyramidal cells are laying in LVb and the majority of horizontal cells are in the superficial LVa. Staining for Etv1 could support this suggestion, however, the antibody employed to stain for Etv1 did not succeed in spite of numerous attempts. The findings can imply that the researched neurons can project further both locally (horizontal) and to distant brain regions (pyramidal cells), which could result in a broader comprehension of the connections inside the cerebral cortex and how the brain works in general.